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Hisar Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸(NTA)为配体，螯合镍离子(Ni2+)后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外，因其基质的耐压性(可耐受最高0.3 MPa的压力)，该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。

• 缓冲液的准备
  缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer在使用前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表2。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表3。
  
• 样品准备
  
  • 细菌表达的蛋白(本说明以细菌表达的蛋白纯化为例)
    
    • 挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
      
    • 表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液(Lysis buffer)和PMSF(PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM)，同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
      
    • 之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/mL。
      注：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
      
    • 将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高，可考虑加入10μg/mL RNase A和5μg/mL DNase I)，混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
      
    • 收集上述澄清蛋白液至离心管中，10000rpm，4℃离心20～30min。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。
  • 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
    将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
    注：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
    
  • 包涵体蛋白纯化(以细菌为例)
    
    • 将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
      
    • 按照菌体：裂解液=1:10(w/v)的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
      
    • 将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20～30min，去上清。可重复步骤b和c一次。
      
    • 按照菌体：裂解液(含8M尿素)=1:10(w/v)的比例将包涵体充分悬浮。
      
    • 变性条件下纯化His标签蛋白纯化。
• 装柱
  
  • 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
    
  • 将树脂悬浮，小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
    
  • 如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
    
  • 打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速，可以用所用泵的最大流速，这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子水。标上柱床高度。注：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%。
    
  • 关闭泵，关闭层析柱出口。
    
  • 如使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
    
  • 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
    
  • 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如需要可重新调整分配器。
• 样品纯化
  装柱后，可用各种常规的中压色谱系统，以AKTA使用为例进行说明：
  
  • 将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，打开下出口，将纯化柱连接到色谱系统中，注意旋紧。
    
  • 3～5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。
    
  • 至少5倍柱体积的Lysis Buffer平衡色谱柱。1mL规格预装柱推荐流速为1mL/min，5mL预装柱推荐流速为5mL/min。
    
  • 利用泵或注射器上样，收集流出液，以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。
    注：若样品粘度增加，即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
    
  • Wash Buffer平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线(一般至少10～15个柱体积)。
    注：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
    
  • Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
    
  • 建议用更高浓度咪唑(如500mM)彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。
• SDS-PAGE检测
  将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

• 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
  使用30%异丙醇清洗5～10个柱体积，接触时间为15～20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1～0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。
  
• 去除离子作用结合的蛋白
  使用1.5M NaCl溶液接触10～15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

• 使用5倍柱体积去离子水清洗填料；
  
• 使用5倍柱体积100mM EDTA(pH8.0)剥落镍离子；
  
• 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
  
• 使用0.5M NaOH清洗5倍柱体积，停留10～15min；
  
• 使用10倍柱体积去离子水清洗填料；
  
• 使用3～5倍柱体积100mM NiSO4再生挂镍；
  
• 去离子水清洗10倍柱体积。
  
• 填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。